ポリメラーゼ連鎖反応（pcr）とは何ですか？ テストの事実、手順、および使用

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）とは何ですか？

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNA鎖が堆積する可能性のあるほとんどすべての液体または表面の中または上にある微量のDNA（場合によってはRNA）を増幅するために使用される技術です。 PCRを理解するための鍵は、すべての人間、動物、植物、寄生虫、細菌、またはウイルスが、その種に固有のDNA（またはRNA）シーケンス（ヌクレオチドシーケンスまたはDNAまたはRNAの断片）などの遺伝物質を含むことを知ることです。そしてその種の個々のメンバーに。 したがって、サンプルにDNAまたはRNAのセグメントが含まれる場合、PCRはこれらの一意の配列を増幅（より多くの同一のコピーを作成）するために使用される方法であるため、非常に高い確率でソースの同一性（a特定の人、動物、または病原体）のほとんどすべてのサンプル内またはサンプル上で見つかった微量のDNAまたはRNA。

ただし、PCR増幅は識別テストの一部にすぎません。 増幅が完了したら（以下を参照）、増幅されたセグメントを既知のソース（たとえば、特定の人、動物、または病原体）からの他のヌクレオチドセグメントと比較する必要があります。 ユニークなセグメントのこの比較は、PCRによって生成されたヌクレオチド配列を、分離ゲル内のヒト、病原体、またはその他のソースからの既知のヌクレオチド配列の隣に配置することによってしばしば行われます。 電流がゲルを流れ、さまざまなヌクレオチド配列が電荷と分子サイズに応じて「はしご」に似たバンドを形成します。 これはゲル電気泳動と呼ばれます。 ゲル内で同じレベルに移行するバンドまたは「ラダー」のようなステップは、ヌクレオチド配列の同一性を示します。 この方法は、PCRテストを完了する最も一般的な方法の1つです（図1を参照）。

図1、PCRのステップのようなバンドまたは「ラダー」はマイコバクテリウムのDNAを生成しました（CDCの提供）

図。 オハイオ州の2人の患者とベネズエラの1人の患者からのMycobacterium cosmeticum分離株の反復エレメント（Rep）–PCR（A）およびパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）（B）パターン。 Rep-PCRはBOXA1Rプライマーを使用して実行され（3）、PFGEは制限酵素AseIを使用して実行されました。 レーン1、2、オハイオ州はOH1とOH2を分離します。 レーン3、4、対照株ATCC BAA-878TおよびATCC BAA-879。 レーン5、ベネズエラの分離株VZ1。 DNAサイズ標準は、100 bp（S1）および48.5 kbマーカー（S2）です。

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）はどのように行われますか？

1983年、Kary MullisはDNA配列を増幅するための基本的な手順を見つけました。 彼とマイケルスミスは、1993年にこの手順を開発したことでノーベル賞を受賞しました。いくつかの基本的な手順が順番に実行されます。 PCRは、適切な化学物質と特別に設計されたヒーターを備えた単一のチューブで行うことができます。 必要な試薬または化学物質は次のとおりです。

• ヌクレオチド配列を含むサンプル（血液、髪、膿、皮膚擦過など）
• DNAプライマー：ヌクレオチドの相補鎖の合成を促進するヌクレオチド配列に付着する短い一本鎖DNA
• DNAポリメラーゼ：DNAにプライマーが結合している場合、DNA構成要素を結合するDNAセグメントを下って相補的な塩基対を形成し、相補的なDNAのヌクレオチド鎖を合成する酵素（耐熱性DNAポリメラーゼTaqの導入耐熱性細菌に由来するポリメラーゼは、PCRを実行する能力を著しく改善しました）
• ヌクレオチド（アデニン、チミジン、シトシン、グアニン、それぞれ略称：A、T、C、G）と呼ばれる大過剰のDNA構成要素が溶液中に存在します。 これらのブロックがリンクされると、ヌクレオチドシーケンスまたはDNAの1本鎖が形成されます。 これらのビルディングブロックが弱い水素結合によって相補的なビルディングブロックに結合すると（たとえば、AはTとのみ結合し、GはCとのみ結合します）、相補的なDNAヌクレオチド配列が形成され、元の一本鎖DNAに結合します。 結合が完了すると、相補的な二本鎖DNAが特定の配列で形成されます。

次に、PCRは、上記の試薬とともにチューブに入れられたサンプルのDNAセグメントから始まります。 溶液は少なくとも94 C（201.2 F）に加熱されます。 この熱により、水素結合が切断され、相補的なDNA鎖が形成されるため、混合物には一本鎖のみが存在します（これは二本鎖DNAの変性と呼ばれます）。

混合物を約54℃（129.2 F）まで冷却させる。 この温度で、DNAプライマーとDNAポリメラーゼは個々の1本鎖DNAに結合します（これはDNAのアニーリングと呼ばれます）。 混合物中のビルディングブロックが過剰（高濃度）であるため、ポリメラーゼはそれらを使用してDNAの新しい相補鎖（DNAの伸長と呼ばれる）を作成し、このプロセスは72 C（161.6 F）でより高速です。 このプロセスは、元の分子の各一本鎖から新しい二本鎖DNA分子を作成します。

このサイクルは、加熱冷却サイクルが自動的に繰り返されるサーマルサイクラーと呼ばれる機械で約40回繰り返され、各DNAシーケンスの量は加熱冷却サイクルが完了するたびに倍増します。 最初はDNAの単一の短いセグメントでしたが、40倍のサイクルを経て約1, 000億コピーに増幅されます。

なぜ医師はPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）テストを注文するのですか？

PCRテストは、医師が患者を診断および治療するのに役立つさまざまな医学的質問に答えることができる多くのテストの基礎を形成します。 たとえば、PCRテストでは、患者の病原体、特に栽培が困難な病原体（HIVやその他のウイルス、特定の真菌など）を検出および特定できます。

他の医師はPCR検査を命じて遺伝病の診断を支援し、他の医師はPCRを使用して子供の親の特定などの生物学的関係を検出します。 PCRテストは、特定のがんに見られる遺伝子変異と再配列を特定し、特徴付けるためにも使用されます。

ただし、PCRテストは変更され、進化生物学、遺伝子フィンガープリンティング、法医学調査、その他多くの科学的調査の多くの側面に拡張されています。

RT-PCRとは何ですか？

RT-PCRは、RNAを検出および測定するために設計されたPCRテストです。 最初のPCRテストではDNAが増幅されましたが、多くのウイルスやその他の生物学的要素（たとえば、ミトコンドリア）はRNAを遺伝物質として利用します。 RT-PCRは、最初にRNAを取得し、RNA鎖をDNA鎖に変換するという点で、従来のPCRとは異なります。 これは、DNAポリメラーゼの代わりに逆転写酵素と呼ばれる酵素を使用することを除いて、上記のPCRと本質的に同じ方法で行われます。 逆転写酵素により、RNAの一本鎖がDNAの相補鎖に翻訳されます。 その反応が起こると、通常のPCR法を使用してDNAを増幅できます。 RT-PCRは、多くのRNAウイルスの検出と研究に使用されています。

RT-PCRは、リアルタイムPCRと呼ばれるPCRの別のバリエーションと混同しないでください。 リアルタイムPCRはPCRのバリエーションで、通常の40サイクルの手順で増幅されたDNAを分析できます。 手順はサイクリングを伴う従来のPCRに似ていますが、リアルタイムPCRは、いくつかの構成要素または小さなヌクレオチド鎖に結合した蛍光色素を使用します。 使用する方法に応じて、増幅されたDNA鎖が形成されると蛍光が発生します。 蛍光の量は40サイクルを通して測定でき、研究者は増幅サイクル中に特定の製品とその量を測定できます。 これにより、多くの場合、研究者や検査技師は、PCR産物の分析に必要なゲル電気泳動やその他の二次手順を省略でき、より迅速な結果が得られます。

リアルタイムPCRおよびRT-PCRは、元のPCRテストのバリエーションまたは変更です。 ただし、特定の問題を解決するために使用されるさらに多くのバリエーション（少なくとも25）があります。 これらはすべて、Assembly PCR、Hot-start PCR、Multiplex PCR、Solid-phase PCRなど、さまざまな名前を持っています。

PCRは、医学、生物学の他の質問に答えるために修正され続ける可能性があります。 およびその他の研究分野。